novaĵoj

IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozido) estas analogo de β-galaktosidasa substrato, kiu estas tre induktebla.Sub la indukto de IPTG, la induktilo povas formi komplekson kun la represorproteino , Tiel ke la formo de la represorproteino estas ŝanĝita, tiel ke ĝi ne povas esti kombinita kun la celgeno, kaj la celgeno estas esprimita efike.Do kiel la koncentriĝo de IPTG estu determinita dum la eksperimento?Ĉu ju pli granda des pli bone?
Unue, ni komprenu la principon de IPTG-indukto: la laktozo-operono (elemento) de E. coli enhavas tri strukturajn genojn, Z, Y, kaj A, kiuj ĉifras β-galaktosidase, permeazon, kaj acetiltransferazon, respektive.lacZ hidrolizas laktozon en glukozon kaj galaktozon, aŭ en alo-laktozon;lacY permesas al laktozo en la medio pasi tra la ĉela membrano kaj eniri la ĉelon;lacA transdonas la acetilgrupon de acetil-CoA ĝis β-galaktozido, kiu implikas forigi Toksan efikon.Krome, ekzistas funkciiga sekvenco O, komencanta sekvenco P kaj reguliga geno I. La I-genkodo estas represorproteino kiu povas ligi al la pozicio O de la funkciigistosekvenco, tiel ke la operono (meta) estas subpremita kaj malŝaltita.Ekzistas ankaŭ ligloko por katabola gena aktivigilo protein-CAP ligloko kontraŭflue de la komenca sekvenco P. La P-sekvenco, O-sekvenco kaj CAP-ligloko kune konsistigas la reguligan regionon de la lak-operono.La kodaj genoj de la tri enzimoj estas reguligitaj per la sama reguliga regiono por atingi la kunordigitan esprimon de genproduktoj.

En foresto de laktozo, la lak-operono (meta) estas en subprema stato.Ĉe tiu tempo, la lac-repremilo esprimita per la I-sekvenco sub la kontrolo de la PI-reklamantsekvenco ligas al la O-sekvenco, kiu malhelpas RNA-polimerazon ligado al la P-sekvenco kaj malhelpas transskriban inicon;kiam laktozo ĉeestas, la lako-operono (meta) povas esti induktita En ĉi tiu operona (meta) sistemo, la vera induktilo ne estas laktozo mem.Laktozo eniras la ĉelon kaj estas katalizita per β-galaktosidase por esti konvertita al alolaktozo.Ĉi-lasta, kiel induktilmolekulo, ligas al la represorproteino kaj ŝanĝas la proteinformiĝon, kiu kondukas al la distanciĝo de la represorproteino de la O-sekvenco kaj transskribo.Isopropylthiogalactoside (IPTG) havas la saman efikon kiel alolaktozo.Ĝi estas tre potenca induktilo, kiu ne estas metaboligita de bakterioj kaj estas tre stabila, do ĝi estas vaste uzata en laboratorioj.

Kiel determini la optimuman koncentriĝon de IPTG?Prenu E. coli kiel ekzemplon.
La E. coli BL21 genetike realigita trostreĉiĝo enhavanta la pozitivan rekombinan pGEX (CGRP/msCT) estis inokulita en LB-likvan medion enhavanta 50μg · mL-1 Amp, kaj kulturita dum la nokto je 37 °C.La ĉi-supra kulturo estis inokulita en 10 botelojn da 50mL freŝa LB-likva medio enhavanta 50μg·mL-1 Amp je proporcio de 1:100 por ekspansio-kulturo, kaj kiam la OD600-valoro estis 0.6~0.8, IPTG estis aldonita al la fina koncentriĝo.Ĝi estas 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Post indukto je la sama temperaturo kaj la sama tempo, 1 mL de la bakteria solvaĵo estis prenita de ĝi, kaj la bakteriaj ĉeloj estis kolektitaj per centrifugado kaj submetitaj al SDS-PAGE por analizi la influon de malsamaj IPTG-koncentriĝoj sur protein-esprimo, kaj tiam elektu la IPTG-koncentriĝon kun la plej granda proteinesprimo.
Post eksperimentoj, oni trovos, ke la koncentriĝo de IPTG ne estas kiel eble plej granda.Ĉi tio estas ĉar IPTG havas certan toksecon al bakterioj.Superi la koncentriĝon ankaŭ mortigos la ĉelon;kaj ĝenerale, ni esperas, ke ju pli solvebla proteino esprimita en la ĉelo, des pli bone, sed en multaj kazoj kiam la koncentriĝo de IPTG estas tro alta, granda kvanto da inkludo formiĝos.Korpo, sed la kvanto de solvebla proteino malpliiĝis.Tial, la plej taŭga IPTG-koncentriĝo ofte ne estas ju pli granda des pli bone, sed ju pli malalta la koncentriĝo.
La celo de indukto kaj kultivado de genetike realigitaj trostreĉoj estas pliigi la rendimenton de la celproteino kaj redukti kostojn.La esprimo de la celgeno estas ne nur trafita de la propraj faktoroj de la trostreĉiĝo kaj la esprimplasmido, sed ankaŭ de aliaj eksteraj kondiĉoj, kiel ekzemple la koncentriĝo de la induktilo, la induktotemperaturo kaj la induktotempo.Tial, ĝenerale, antaŭ ol nekonata proteino estas esprimita kaj purigita, estas plej bone studi la induktan tempon, temperaturon kaj IPTG-koncentriĝon por elekti la taŭgajn kondiĉojn kaj akiri la plej bonajn eksperimentajn rezultojn.